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Wie wir in der Genomik von der Probe zum Resultat gelangen

  • timer  5.5 Minuten Lesedauer
  • 24. November 2020
  • Geschrieben von Michèle Heidemeyer
  • Life Science

Die biologische Forschung wird durch neue Methoden immer schneller. Von der Probe zum genetischen Code – alles eine Frage der Zeit?

In der Wissenschaft startet die Zeitrechnung meist mit der zu untersuchenden Probe. Je nach Bedarf wird die Probe noch stabilisiert. Gerade für die Analyse von gDNA, ccfDNA, RNA, CTCs oder Proteinen aus Blutproben empfiehlt sich diese Methode.


Start eines jeden Experiments ist die Probe

Zunächst beginnt die Probenaufbereitung. In den meisten Fällen wird unabhängig vom Ausgangsmaterial (Blut, Gewebe, Virus, Bakterium oder Urin) eine Nukleinsäure-Extraktion durchgeführt. Hierfür können handelsübliche Extraktionskits, spezielle Aufschlussverfahren oder automatisierte Systeme verwendet werden.

Für all diejenigen, die unter Zeitdruck stehen, gibt es heute bereits Mastermixe, die so robuste Polymerase beinhalten, dass eine direkte Amplifikation aus der Probe ganz ohne Aufreinigung möglich ist. Selbst schwierige Gewebe wie Maus-Earclips, einige Pflanzen oder Hefen lassen sich so sehr zeiteffizient direkt analysieren.

In der Diagnostik wird anschliessend an die Aufreinigung häufig direkt die Analyse in Form einer Amplifikation durchgeführt. Gerade zur Erkennung von Erbkrankheiten oder Virusinfektionen ist diese Methode der PCR eine sehr schnelle und kostengünstige Variante. In der Wissenschaft hingegen wird eine Probe häufig erst noch weiter verarbeitet. Für das Klonieren von Genen wird die PCR meist nur zur Verstärkung des DNA-Fragments benötigt. Sobald die gewünschte Menge vorhanden ist, wird fröhlich modifiziert, geschnitten und legiert. Je nach Anwendung hat die Industrie die passenden Produkte parat. Von Standard-Polymerasen für „einfache“ Vervielfältigungen über HiFi- und Mega-HiFi-Polymerase kann die Wissenschaft heute quasi alles bis hin zu 20kb bearbeiten.

 

Qualität und Quantität

Wer nicht nur wissen möchte, ob eine spezielle Nukleinsäure vorhanden ist, sondern auch wie viel davon, der nutzt die Methode der quantitativen PCR – kurz qPCR. Hierbei wird mit Hilfe von DNA-Farbstoffen die Menge der PCR-Produkte ermittelt. Zum Leidwesen der Wissenschaft werden hierbei allerdings sowohl spezifische als auch unspezifische PCR-Produkte detektiert. Für Anwendungen wie Pathway-Analysen, microRNA-Nachweise oder Multiplexing verwendet man daher häufig für ein Zielgen spezifische fluorogene Sonden.

Eine amplifizierte Probe sollte abschliessend immer auf einem Gel analysiert werden. Nur so kann man sich über die Reinheit und den Zustand (Degradation) der Probe informieren. Glücklicherweise ist man heute in den meisten Laboren von Ethidiumbromid abgekommen und nutzt sogenannte „Safe Dyes“, die weniger kanzerogen sind. Besondere Safe Dyes sind sogar bereits in der Lage, DNA und RNA getrennt voneinander zu färben und so eine Aussage über DNA-Kontamination in RNA-Proben zu treffen.

 

DNA-Molekül-Analyse

Heute nicht mehr wegzudenken ist das Sequenzieren der DNA als Abschlussanalyse. Hierbei ist die Reinheit der Probe besonders wichtig; daher empfiehlt es sich, vor Beginn eine Aufreinigung durchzuführen. Es gibt spezielle Kits, die enzymatische Überreste aus vorangehenden PCRs entfernen. Ebenso kann man Dye-Terminatoren aus vorangegangenen Schritten einfach mit entsprechenden Kits entfernen.


Wir können die Funktion und Struktur ganzer Genome innerhalb einiger Stunden analysieren und über Nacht sequenzieren. Im Vergleich dazu dauerte die Durchführung eines typischen Amplifikationsprotokolls mit 30 Zyklen vor knapp zehn Jahren noch ungefähr 3 Stunden. Dank immer besserer Reagenzien und Kits können wir heute davon ausgehen, dass die Diagnose, Prognose und Behandlung von Krebs und vielen anderen Krankheiten in den nächsten Jahren noch schneller voranschreiten wird und wir unsere kostbare Zeit noch effizienter nutzen können. Zeit ist eben doch relativ!

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